近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花團隊在Plant Biotechnology Journal上發(fā)表了題為“全基因組測序揭示在CRISPR/Cas9編輯的棉花植株中，脫靶突變很少更多地是受體材料固有遺傳或/和體細胞無性系變異”的文章（Whole genome sequencing reveals rare off-target mutations and considerable inherent genetic or/and somaclonal variations in CRISPR/Cas9-edited cotton plants）的研究論文。植科院三位博士生李健英、Hakim和孫琳為并列第一作者，金雙俠教授為該論文通訊作者。
該論文利用高通量測序的方法，詳細評估了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在棉花基因編輯過程中的脫靶效應(yīng)。通過對野生型對照、陰性再生植株、Cas9編輯的陽性植株進行全基因測序，結(jié)果證明了CRISPR/Cas9編輯后代中存在數(shù)千個SNP/Indels 變異, 這些遺傳變異來源于同一親本的后代個體間的差異或者組織培養(yǎng)過程中的體細胞變異，其數(shù)量遠遠大于CRISPR脫靶位點的數(shù)量，結(jié)果表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在多倍體植物基因組編輯具有高度特異性、脫靶率極低。
基因組編輯技術(shù)是當(dāng)前生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已用于治愈人類遺傳病、實現(xiàn)細胞個性化治療、開發(fā)新藥、作物遺傳改良等領(lǐng)域。CRISPR/Cas9技術(shù)依賴于Cas9核酸酶在gRNA指導(dǎo)下在PAM位點的上游3個堿基的位點切割目標DNA（On-target），但也會切割非靶標的位點（與sgRNA靶標位點序列相似，且具有PAM位點），這就造成所謂的Off-taget（脫靶），從而引起不可控的突變。因此，CRISPR技術(shù)存在的脫靶效應(yīng)（Off-target effect）風(fēng)險是影響CRISPR技術(shù)能否廣泛應(yīng)用的主要限制因素，如何正確評估及降低脫靶效應(yīng)是當(dāng)前亟待解決的問題。關(guān)于CRISPR脫靶效應(yīng)，在動物的基因編輯中已經(jīng)有比較系統(tǒng)的報道，而關(guān)于植物脫靶效應(yīng)在擬南芥、水稻等二倍體模式植物中有少量報道，幾乎沒有檢測到任何非靶標突變?？紤]到這些研究的不足之處，在植物中開展脫靶效應(yīng)的深度評估，就具有重要的理論和實踐意義。
本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對14個Cas9編輯植株，再加上3 株野生型 和3個再生群體中的陰性單株作為對照進行35×測序深度進行全基因組測序。 研究結(jié)果表明，通過比較野生型和陰性對照，每個 Cas9 編輯的單株后代有 4188 ~ 6404 的 SNPs和 312 ~ 745 indels 變異，進一步對這些變異位點的側(cè)翼序列分析，與靶位點沒有同源性，絕大多數(shù)位點都缺少PAM位點。通過研究可推斷出這些變異位點來源于受體材料的不同后代（同一品種不同單株）之間的存在遺傳差異以及棉花組織培養(yǎng)過程中的大量存在的體細胞無性系變異。 接下來，在4413個通過軟件預(yù)測的潛在脫靶位點中僅檢測到4個發(fā)生了真實的脫靶突變，并用Sanger測序證實。 同時，通過對受體材料JIN668和TM-1參考基因組遺傳變異進行分析，檢測到61個因為不同材料間的遺傳變異可以產(chǎn)生新的脫靶位點，這些結(jié)果表明在設(shè)計sgRNA時要高度關(guān)注轉(zhuǎn)基因母體基因組與參考基因組的遺傳變異，利用計算程序減小脫靶風(fēng)險性。
這篇報道是2017年棉花團隊建立高效基因編輯體系基礎(chǔ)上的后續(xù)系列報道, 這兩個研究說明了該團隊建立的基因編輯系統(tǒng)，具有極高的編輯效率（平均85%的編輯效率）和高度特異性，完全可以滿足棉花功能基因組的研究需求。據(jù)悉，本研究工作得到國家轉(zhuǎn)基因重大專項和國家基礎(chǔ)基金項目資助。